发光标签揭示致病回路的瞬间活性

莱斯大学的合成生物学家开发了第一种技术，用于观察细菌中一些最常见的信号处理回路的实时活动，包括使用这些回路增加毒力并产生抗生素耐药性的致命病原体。

双组分系统是细菌用来对周围环境做出反应并生存的感觉回路。细菌利用这些回路，也称为信号转导途径，来感知从光和金属离子到pH值的“无与伦比的刺激范围”，甚至来自朋友和邻居的信息，莱斯生物工程教授Jeffrey Tabor说。

Tabor和博士后研究员Ryan Butcher用于观察双组分系统中实时磷酸化反应的新光学工具在发表在《美国国家科学院院刊》上的一项研究中进行了描述。

“细菌使用双组分系统来激活毒力和抗生素耐药性，定植人类和植物宿主，形成生物膜和污染医疗设备，”生物工程和生物科学教授Tabor说。

Tabor的实验室多年来一直在研究双组分系统。2019年，他的团队推出了一个生物黑客工具包，合成生物学家可以使用该工具包来混合和匹配电路中的数以万计的感官输入和遗传输出。

该工具包最重要的用途之一是解开双组分系统的双重奥秘。顾名思义，这些电路有两个功能：感应细胞外的刺激，并改变细胞的行为以响应该刺激。

第一种成分，称为传感器激酶，通常突出穿过细胞的外壁，只能由特定的化学信号激活。一旦被触发，它就会引发生化级联反应，即细胞内的连锁反应，以细胞响应刺激而改变其行为而告终。

级联的第一步是磷酸化，最终导致系统的第二个组件，即响应调节剂的激活。

尽管磷酸化反应是细菌中数以万计的双组分系统的关键，但很难直接在活细菌中观察到它们。这部分是因为反应调节因子通常必须加入成对，以继续进行导致刺激反应的生物级联。

“磷酸化的实验分析通常需要从细菌中纯化蛋白质，并使用费力的体外方法(如凝胶电泳)进行分析，”Butcher说。

Butcher创造了一种更简单的方法，使用荧光蛋白标签和偏振荧光。他设计了大肠杆菌菌株来生产mNeonGreen荧光蛋白探针，使来自激发激光的光去偏振，但前提是它们成对相互作用。在各种测试中，Butcher和Tabor表明他们的方法可用于监测各种环境条件下响应调节器激活的幅度和速度。

该方法称为“同型荧光共振能量转移”，简称同型FRET。Tabor说，研究人员可以使用它来跟踪双组分系统的激活，其时间分辨率比以前高得多。

在这项研究中，他和Butcher通过观察硝酸盐激活的双组分系统证明了homo-FRET的效用，该系统已知在大肠杆菌，沙门氏菌和其他病原体的胃肠道定植中发挥作用。

“微生物学家已经知道这种遗传回路被几种病原体使用，但我们仍然不完全了解它是如何工作的，”Tabor说。

使用他们的方法，Tabor和Butcher在电路中发现了以前未报道的活动脉冲，以响应添加硝酸盐。脉冲似乎是由于双组分系统的快速激活而出现的，随后细菌消耗硝酸盐并相应失活。

“这是了解这个电路如何工作的窗口，而且使用以前的方法很难确定这种事情，”Tabor说。“通过同频，我们可以观察电路在发生时对硝酸盐水平变化的反应”。

“我们认为homo-FRET可用于设计生物传感器，其响应速度比目前的替代品快10倍，我们和其他人将能够使用它在一系列其他细菌途径中做出新发现，”他说。